毕赤酵母电转化试剂盒

03使用说明：

实验流程概述

1.        从新鲜的平板上挑取单菌落，接种于5 mL YPD试管，30℃，250 rpm培养过夜；

2.        从试管中转接适量菌(约1~2 mL)至25 mL的YPD摇瓶中，调整初始接种OD600 在0.15~0.20范围内；

3.        30℃，250 rpm的条件下摇瓶培养4-5 h，使OD600到达0.8~1.0之间（毕赤酵母复制一代大概需要的时间在100-120 min）；

4.        将培养液在无菌环境下转移到50 mL离心管中，5000 rpm离心5 min后弃去上清；

5.        加入9 mL的Buffer P1和1 mL 1M DTT（预先分装化冻）将菌体重悬；重悬液置于30℃，100 rpm（或室温）的环境中反应5min；

6.        将混悬液5000 rpm离心5 min，然后弃去上清。用1 mL的Buffer P2重悬沉淀；

7.        将上一步的混悬液5000 rpm离心30 s，弃上清后用200 μL Buffer P3重悬沉淀；感受态细胞至此制备完成（将感受态置于冰上，余下的菌可在-80℃的温度下将细胞缓慢冷冻，-80℃条件下感受态细胞至少可以保存6个月）。

8.        取40 µL 感受态细胞， 1000~2000 ng DNA，混合均匀，转移到预冷的电转杯中，进行电转化；

9.        电转的参数如下:常用伯乐电转化系统Gene Pulser®II electroporator (Bio-Rad Laboratories, Hercules，美国加州)：电极杯间隙 2.0 mm；充电电压1500 V；抵抗200 Ω；电容25 µF；

10.     电极杯完成电转后，根据筛选标记来添加不同的复苏培养基

a.       如进行筛选缺陷型菌株，加入1 mL  的山梨醇（1M，试剂盒已配备），混匀后，取80-120 µL涂布；

b.      如果是筛选带有抗性的菌株，则需要加入1 mL 山梨醇和YPD 1：1混匀的混合液，30℃，250 rpm孵育2-4 h，取80-200 µL涂布；

c.       如果是筛选带有缺陷型+抗性的菌株，则需要加入1 mL 山梨醇和YPD 1：1混匀的混合液，30℃，250 rpm孵育2-4 h，取80-200 µL离心后用无菌水洗涤2次后涂布于对应平板上。

04 常见问题与解决方案：

常见培养基配方

YPD (1 L): 10 g酵母提取物，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖（YPD的葡萄糖需要单独灭或者过滤除菌，使用前混匀）。

YPM (1 L): 10 g酵母提取物，20 g蛋白胨，20 mL甲醇（甲醇过滤即可，使用前混匀）。

SC (1 L): 1.7 g YNB, 5 g硫酸铵, 20 g葡萄糖，氨基酸粉末~0.77g/L。

平板上克隆数目很少。

可能是转化率过低导致，调整菌涂布量或者增加DNA用量后尝试。