5✖Seamless Cloning Kit (无缝克隆试剂盒)

实验流程概述

1.      线性化载体的制备

载体的线性化可以通过在目标载体上选择合适的位点进行双酶切或单酶切，同时对酶切后的产物进行胶回收纯化（酶切后的质粒骨架琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带，与未切质粒对照跑胶位置不同）。此外也可质粒插入位点的左右两侧设计方向相反的引物通过PCR的方式来线性化质粒（PCR的模板质粒建议稀释100倍以上（1ng/µL以下，推荐模板加入量0.1~1ng）或根据PCR mix推荐量加入最低量模板），△此外也可通过DpnI酶消化环形质粒模板来降低假阳性； PCR扩增获得的线性化载体需要进行琼脂糖凝胶电泳和切胶纯化。

2.      插入片段的制备及引物设计

插入片段获得： 由PCR制备，所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源序列，使得扩增产物之间以及扩增产物与线性化载体之间各有20~25 bp的同源序列。重组反应：将线性化载体和各插入片段按比例混合，在体系中重组酶催化下， 50℃反应15 min即可完成重组反应，实现多个线性化DNA的体外环化。转化感受态细胞：重组产物直接进行转化，平板上会形成数百个单克隆供后期阳性筛选。

3.      线性化载体与插入片段的使用量

3.1 浓度测定：

线性化载体与插入片段进行胶回收纯化，且经电泳检测无明显杂带，Nanodrop等基于吸光值的仪器进行浓度测定，A260/A280最佳范围在1.8 - 2.0之间。

3.2. 载体、片段使用量计算：

Seamless Cloning Kit试剂盒兼容一至五个片段同源重组，试剂盒提供的pUC18 Linearized vector (25 ng/µl) 可作为重组载体与插入片段进行重组反应。对于单片段同源重组反应， 最适克隆载体使用量为0.03 pmol，最适插入片段使用量为0.06 pmol(载体与插入片段摩尔比为1 : 2)。对于多片段同源重组反应，最适DNA使用量为每个片段(包括线性化载体)各0.03 pmol(载体与插入片段摩尔比为1 : 1)。

△对于单片段同源重组反应：

最适克隆载体使用量 = 50~100 ng

最适插入片段使用量 = 100~200 ng

△对于多片段同源重组反应：

最适克隆载体使用量 =50~100 ng

每个片段的最适使用量 = 100~200 ng

a 对于单片段同源重组反应， 插入片段的使用量应大于20 ng。 当插入片段长度大于克隆载体时，最适克隆载体与插入片段使用量的计算方式应互换，即将插入片段当做克隆载体，克隆载体当做插入片段进行计算。

b线性化克隆载体的使用量应在50 - 200 ng之间。当使用上述公式计算DNA最适使用量超出这个范围时，直接选择最低/最高使用量即可。

3.3.   连接反应

取出试剂盒的5ÍSeamless Cloning Mix 组分， Nuclease free water置于室温，其余置于冰上。参考下表配制如下反应体系

3.4 上述反应体系置于30ºC孵育30 min(插入1个片段)、 30~60 min(同时插入2~3个片段)或60 min(同时插入4-5个片段)。 反应完成后如不能立即进行后续操作，可将反应样品保存于-20ºC。

4.      转化及克隆鉴定

4.1取5µl上一步骤的反应样品加入到50-100µl DH5α等感受态细胞中(注意所加入的DNA样品体积不要超过感受态体积的1/10)，轻轻混匀，将该混合物置于冰上30min。

4.2 42ºC水浴中90秒进行热激，然后迅速放回冰浴中，静置3~5min。

4.3加入500 µl不含抗生素的SOC或LB培养液，轻轻混匀， 37ºC震荡培养1h。

4.4将菌液5000 rpm离心1 min以沉淀菌体。 吸去大部分培养液，剩余约50-100µl的培养液， 重悬菌体。 然后全部均匀涂布到含适当抗生素的LB平板上， 37ºC培养箱中培养过夜。

4.5第二天挑取平板上的克隆进行菌落PCR或者提取质粒进行酶切鉴定，也可以直接选取数个克隆进行测序鉴定。